研究人員開發(fā)了一種新的顯微鏡技術(shù)，可以從包括大腦在內(nèi)的生物組織內(nèi)約100微米深處獲得亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的三維超分辨率圖像。 通過讓科學(xué)家更深入地觀察大腦，該方法可以幫助揭示隨著時間的推移、在學(xué)習(xí)過程中或由于疾病而在神經(jīng)元中發(fā)生的微妙變化。
這種新方法是STED顯微鏡的延伸，這是一種突破性的技術(shù)，通過克服光學(xué)顯微鏡的傳統(tǒng)衍射限制，實現(xiàn)了納米級的分辨率。斯特凡·赫爾因開發(fā)這種超分辨率成像技術(shù)而獲得2014年諾貝爾化學(xué)獎。
在光學(xué)學(xué)會(OSA)的高影響力研究雜志《Optica》上，研究人員描述了他們?nèi)绾问褂盟麄兊男耂TED顯微鏡，以超分辨率對活體小鼠大腦深處的樹突狀刺的三維結(jié)構(gòu)進行成像。樹突棘是神經(jīng)元樹枝上的微小突起，它接受來自鄰近神經(jīng)元的突觸輸入，在神經(jīng)元活動中起著至關(guān)重要的作用。
"我們的顯微鏡是世界上第一臺在活體動物體內(nèi)深處實現(xiàn)3D STED超分辨率的儀器，"研究小組負(fù)責(zé)人、耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Joerg Bewersdorf說。"Bewersdorf說："深層組織成像技術(shù)的這種進步將使研究人員能夠直接觀察到原生組織環(huán)境中的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和動態(tài)變化。"以這種方式研究細(xì)胞行為的能力對于全面了解生物醫(yī)學(xué)研究以及藥物開發(fā)的生物現(xiàn)象至關(guān)重要"。
研究人員使用他的3D-2PE-STED顯微鏡對一只活體小鼠的大腦進行成像。放大樹突的一部分可以看到單個脊柱的三維結(jié)構(gòu)。資料來源：Joerg Bewersdorf，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院。
更深入的研究
傳統(tǒng)的STED顯微鏡最常被用來為培養(yǎng)的細(xì)胞標(biāo)本成像。使用該技術(shù)對厚的組織或活體動物進行成像是一個很大的挑戰(zhàn)，特別是當(dāng)STED的超分辨率優(yōu)勢被擴展到三維STED的第三維時。出現(xiàn)這種限制是因為厚而密集的組織阻礙了光線的深入和正確聚焦，從而損害了STED顯微鏡的超分辨率能力。
為了克服這一挑戰(zhàn)，研究人員將STED顯微鏡與雙光子激發(fā)(2PE)和自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)相結(jié)合。"論文第一作者Mary Grace M. Velasco說："2PE通過使用近紅外波長而不是可見光，能夠在組織的更深處成像。"紅外光不易受散射影響，因此能更好地穿透到組織深處"。
研究人員還在他們的系統(tǒng)中加入了自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)。"Velasco說："使用自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)可以糾正光線形狀的扭曲，即光學(xué)畸變，這些畸變在組織內(nèi)和通過組織成像時出現(xiàn)。"在成像過程中，自適應(yīng)元件以與標(biāo)本中的組織完全相反的方式修改光波。因此，來自自適應(yīng)元件的畸變抵消了來自組織的畸變，從而創(chuàng)造了理想的成像條件，使STED的超分辨率能力在所有三維空間得到恢復(fù)。
看清大腦中的變化
研究人員首先通過對蓋玻片上的培養(yǎng)細(xì)胞的特征結(jié)構(gòu)進行成像來測試他們的3D-2PE-STED技術(shù)。與單獨使用2PE相比，3D-2PE-STED解決了體積小10倍以上的問題。他們還表明，他們的顯微鏡可以比傳統(tǒng)的雙光子顯微鏡更好地分辨小鼠皮膚細(xì)胞核中的DNA分布。
在這些測試之后，研究人員使用他們的3D-2PE-STED顯微鏡對一只活體小鼠的大腦進行成像。他們放大了樹突的一部分，并解決了單個刺的三維結(jié)構(gòu)。兩天后，他們對同一區(qū)域進行了成像，結(jié)果顯示，在這段時間內(nèi)脊柱結(jié)構(gòu)確實發(fā)生了變化。研究人員沒有在他們的圖像中觀察到神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的任何變化，也沒有在小鼠的行為中觀察到可能表明成像造成的損害，他們計劃對此進行進一步研究。
Velasco說："樹突棘非常小，如果沒有超分辨率，就很難看到它們的確切三維形狀，更不用說這種形狀隨著時間的推移而發(fā)生的任何變化。3D-2PE-STED現(xiàn)在提供了觀察這些變化的手段，而且不僅是在大腦的表層，而且是在更深的內(nèi)部，在那里有更多有趣的連接發(fā)生。"
